Онколитический вирус болезни Ньюкасла и аутологичные опухолевые клетки в комплексной терапии рака
В.В. Кешелава
лауреат государственной премии, д.м.н.
руководитель отделения онкопатологии ФГУ «РНЦРР» Росздрава, г. Москва Oncolytic Newcastle disease virus and tumor cells in complex cancer therapy
Keshelava V.V.
Federal State Enterprise “Russian Scientific Center of Roentgenoradiology of Russian Health and Social Development Ministry”.
Abstract
The progress in oncological diseases treatment is due to significant achievements of molecular biology, immunology and development of immunotherapy methodology. One of the most perspective methods is known to be antitumor vaccination with vaccines containing intact tumor cells (autologic and allogenic), autologic hit shock proteins, Newcastle disease virus (NDV).
Antitumor vaccines generation methods and their role in cancer prophylaxis and treatment has been worked out and recognized. Wide experience of these vaccines usage has been collected by clinical oncologists and their effectiveness has been recognized by many clinics over the world.
Autologic vaccine consists of tumor cells exposed during the tumor extraction.
The interclinical prospective nonrandomized research of vaccines’ effectiveness and toxicity held in 2004–2006 included 46 patients with skin melanoma (9 patients), breast cancer (21 patient), large intestine cancer (7 patients), cervix cancer (5 patients), ovarian cancer (1 patient), uveal melanoma (2 patients), vagina cancer (1 patient). Medium age of the patients was 54,2.The majority of patients suffered disseminated tumor process with multiple metastasis affecting several organs and resistant to radial and chemotherapy. Almost all patients were treated on an outpatient basis. So they were leading their common life during the treatment. There were no complications noticed. At the end of the first course of treatment pain and metastasis were reduced, the patients rejected narcotics and anaesthetics, became active, their appetites and weight improved. Due to low toxicity it became possible to continue treatment up to one year and even longer to get stable results.
За последние годы в онкологии сделано много, но решающего прорыва не произошло. Все чаще в отечественной и зарубежной литературе появляются сообщения несколько сенсационного плана, свидетельствующие о переломном моменте в лечении больных раком. Прогресс в лечении онкологических заболеваний связан с существенным прорывом в молекулярной биологии, иммунологии, развитии методов иммунотерапии, из которых наиболее перспективным представляется создание противоопухолевых вакцин: на основе цельных опухолевых клеток (аутологичных и аллогенных); ДНК или РНК – вакцины; рекомбинантные вирусные или бактериальные вакцины; вакцины на основе аутологичных белков теплового шока и др. (1,2,7.8).
Клиническая онкология имеет большой опыт использования противоопухолевых вакцин эффективность применения которых доказана во многих клиниках мира. При этом разработаны и общепризнанны методы получения противоопухолевых вакцин и определено их место в профилактике и лечении рака (2.3.5.7.8.).
Существует множество различных штаммов ВБН, все они классифицированы как литические (лизирующие клетки: МТН-68,73-Т, Roakin, PV701) и нелитические (Ульстер) для человеческих клеток и изучались как противораковые агенты(4-8).
Исследователи при этом предполагают три клеточных механизма взаимодействия. Первый механизм – литические штаммы вируса напрямую уничтожают опухоли. Второй – с помощью нелитических штаммов белки вируса проникают в мембрану опухолевых клеток, вызывая иммунную реакцию. И, наконец, сам вирус может стимулировать организм носителя вырабатывать цитокины: интерфероны и фактор некроза опухоли (TNF), что ведет в свою очередь к активации естественных клеток-убийц, макрофагов и сенсибилизированных Т-клеток.
Во всех случаях отмечен положительный эффект применения, как чисто вирусной терапии, так и аутологичной вакцинации вирус модифицированными опухолевыми клетками. Некоторые противоопухолевые вакцины в настоящее время завершают III фазу клинических испытаний и по мнению большинства исследователей уже в недалеком будущем активная иммунотерапия станет стандартным методом и частью комплексного лечения рака (4-8).
Нами проанализированы результаты и возможности вакцинотерапии большинства клиник, обобщен опыт работы общепризнанных специалистов и с 2003 года начаты экспериментальные и клинические исследования по данной проблеме в рамках допустимых и принятых медицинских программ с учетом мирового опыта в процессе клинических испытаний, в том числе и России.
Была поставлена задача оптимизации и совершенствования имеющихся технологий получения аутологичных и модифицированных ВБН вакцин, а также онколитического ВБН для использования у пациентов с различными злокачественными заболеваниями.
Применяемый нами вирус Болезни Ньюкасла, живая вакцина для птицеводства, апатогеный штамм Ла-Сота выращивается в свободных от патогенной микрофлоры куриных эмбрионах. Для внесения в человеческие опухолевые клетки и для инъекций пациентам вирус очищали ультрацентрифугированием и проверяли на стерильность и безвредность. Оценка токсичности препарата (вакцины) проводилась в соответствии с критериями, рекомендованными ВОЗ. Препарат при необходимости может быть лиофилизован, сохраняя при этом свои свойства в течение одного года.
Для приготовления аутологичной вакцины используют опухолевые клетки, выделенные непосредственно в ходе удаления опухоли. Технология приготовления вакцины общеизвестна и предполагает дезагрегацию образцов опухоли, культивирование клеток, облучение клеток с целью блокады их пролиферативной активности и различные приемы модификации с целью повышения ее эффективности. Этап создания культуры опухолевых клеток представляет собой сложный и неоднозначный процесс. По мнению абсолютного большинства исследователей, существуют значительные трудности и особенности в создании условий, благоприятных для индивидуальных первичных культур опухолевых клеток. Выживание клеток и их пролиферация возможны только лишь при воссоздании всех внешних условий, которые клетки имели in vivo. Разработанные и применяемые нами оригинальные технологии выделения и культивирования клеток позволяют получить пролиферирующие первичные культуры более чем 70% случаев для таких опухолей как меланома кожи, рак почки, толстой кишки, яичников и молочной железы, а клеточные линии – не менее чем в 50% случаев.
Более специфическую аутовакцину получали из размножающихся in vitro клетках – перевиваемых опухолевых линиях. Такие линии могут быть получены из операционного или биопсийного материала и могут размножаться бесконечно долго, обеспечивая необходимое для вакцинации количество гомогенных опухолевых клеток. Эти линии также замораживали, инактивировали гамма-излучением и обрабатывали вирусом перед введением пациентам.
Известно, принцип действия противоопухолевых вакцин основан на усилении противоопухолевой защиты, заложенной в природе иммунитета здорового человека. Недостаточность противоопухолевого иммунитета обусловлена растущей опухолью и/или прогрессированием с возникновением множества метастазов и иммунодепрессивным эффектом противоопухолевой химиотерапии и облучения.
Усиление эффективности противоопухолевых вакцин путем повышения иммуногенности опухолевых антигенов нами достигалась модификацией вакцины непатогенным вирусом (ВБН) и использованием человеческого рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора (Г-КСФ). Основное биологическое действие Г-КСФ – гемопоэтическое, главным образом нейтрофилопоэтическое. Его введение в организм приводит к увеличению содержания в крови функционально активных нейтрофилов. Кроме этого препарат повышает биохимическую (синтез протеаз), фагоцитарную, хемотаксическую активности, усиливает в организме синтез других цитокинов (интерферонов, трансформирующего фактора роста β и др.). Тем самым активизируются различные неспецифические и специфические механизмы защиты организма.
Предварительная клиническая и иммунологическая оценка эффективности вакцинотерапии в сочетании с Г-КСФ, а так же наличие клеточных линий полученных на этапах создании позволили пересмотреть принципы и подходы химиотерапии в данном комплексе лечения. Правильный подбор препаратов избирательно действующих на опухолевые клетки, выбор оптимальной дозы, режима и способа применения позволяли проводить курсы химиотерапии длительно без каких-либо осложнений в течение всего курса вакцинотерапии.
Предполагая данную комплексную методику лечения рака, мы учитывали те слабые сторон аутовакцин, где результат зависит от индивидуальных особенностей противоопухолевого иммунитета, а опухоль характеризуется не только множественностью антигенов, но и повышенной мутационной активностью с дальнейшим усилением признаков злокачественности.
Проведенные медико-биологические исследования показали высокую эффективность предлагаемой модели патогенетической терапии и позволили с учетом в рамках допустимых и принятых медицинских программ провести клинические испытания на определенной группе больных с различными злокачественными новообразованиями.
Цель данного исследования: оценить объективный непосредственный эффект и его продолжительность, время до прогрессирования, выживаемость, качество жизни больных с различными злокачественными заболеваниями при использовании как аутологичных, облученных вакцин модифицированных ВБН (группа А), так и получивших онколитический вирус ВБН в чистом виде (группа В) в плане комплексного лечения.
Для отбора больных были использованы общепринятые в клинической практике критерии.
Критерии включения:
Список использованной литературы
Симптомы и лечение болезни Ньюкасла у домашней птицы
Болезнь Ньюкасла — острое и очень заразное заболевание, поражающее домашнюю птицу. В основном её жертвами становятся представители семейства куриных — индейки, цесарки, павлины, куры, фазаны, а также голуби. Большинство заражённых особей погибает, процент смертности составляет от 60 до 90%. Эффективного лечения болезни до сих пор не существует, поэтому основные силы в борьбе с ней направлены на профилактику возникновения и обеспечение карантинных мероприятий, исключающих её дальнейшее распространение.
Описание болезни и её история
Болезнь Ньюкасла имеет несколько названий — псевдочума, чума брауншвейгская, азиатская или атипичная, Ньюкаслская болезнь, болезнь Дойля, псевдоэнцефалит.
В 1926 году заболевание впервые диагностировал вирусолог Краневельд, когда находился на острове Ява. В 1927 году исследователем Дойлем была зафиксирована вспышка заболеваемости вблизи английского города Ньюкасла. Начиная с этого времени признаки болезни встречаются на территории Азии, Европы и Америки. В 1935 году в США это заболевание упомянуто как псевдоэнцефалит цыплят.
Во время Великой Отечественной войны болезнь была широко распространена на территории Советского Союза. Советскими учёными Свинцовым П. Н., Фоминой А. Я. и Агаповым С. И. была синтезирована специальная вакцина против Ньюкаслской болезни.
Возбудитель
Болезнь развивается в результате заражения птицы парамиксовирусом PMV-1, который имеет множество штаммов. Все они делятся на четыре основных группы:
Парамиксовирус PMV-1 под микроскопом
Возбудитель может долго существовать в местах обитания птицы. Летом этот срок составляет около недели, а зимой достигает 5 месяцев. Продолжительность жизни вируса зависит от внешних раздражителей:
Вирус отличается высокой жизнеспособностью и устойчивостью к внешним условиям, но всё же чувствителен к повышению температуры, сдвиге pH среды в кислую сторону и дезрастворам — хлороформу и эфиру.
Механизм и источники заражения
Выделяется вирус из организма с помётом, яйцами и различными биологическими жидкостями. Основной путь передачи вируса — воздушно-капельный. Именно этим объясняется наличие большого радиуса заражения, нередко достигающего десяти километров. Кроме этого, в распространении вируса немаловажную роль играет вода, корм, пух, перья и мясо, взятые от заражённой птицы.
Основные источники заражения:
У кур с момента заражения до появления первых симптомов может пройти от 3 до 12 дней. Сам вирус можно выявить уже через сутки после заражения. После исчезновения признаков заболевания он сохраняется в организме птицы в течение 2–4 месяцев.
Обычно Ньюкаслская болезнь носит сезонный характер. Её вспышки чаще всего приходятся на летне-осенний период. Это связано с ростом поголовья птицы и усилением контакта с ней. На птицефабриках инфекция может присутствовать постоянно благодаря высокой устойчивости вируса в зимний период и носительству вируса переболевшими особями.
Признаки и формы атипичной чумы
Степень выраженности проявлений псевдоэнцефалита зависит от штамма вируса и от того, была ли проведена вакцинация поголовья.
Острое течение Ньюкаслской болезни чаще всего наблюдается у непривитых представителей домашней птицы. Заболевание развивается стремительно и затрагивает всё стадо менее чем за трое суток. Процент смертности нередко достигает 100% за 2-3 дня. Характерными симптомами острой формы атипичной чумы являются:
Внешний вид больного голубя
У вакцинированных цыплят бройлеров и индюков псевдочума носит подострое течение, при котором также поражается нервная, пищеварительная и дыхательная система. Для этой формы характерны:
На крупных птицефермах, где проводится регулярная вакцинация молодняка, вирус практически постоянно присутствует в окружающей среде. В результате этого болезнь приобретает атипичное течение, для которого характерно:
Смертность при атипичном течении болезни не превышает 15%.
Иногда болезнь Ньюкасла имеет молниеносное течение, при котором гибель птицы наступает до появления первых симптомов. Или приобретает хроническую форму, которая уносит жизни 10–20% всего стада. Кроме этого, существует бессимптомная форма заболевания, протекающая в виде кишечной инфекции.
Кроме этого, существует ещё несколько форм болезни Ньюкасла, которые представлены в таблице:
Диагностика
Распознать псевдочуму только по её симптомам очень сложно, так как существуют и другие болезни с похожими признаками:
Поставить точный диагноз возможно только после выявления вируса. Для этого из органов погибшей птицы — мозга, печени, трахеи или селезёнки, изготавливают специальный препарат, который вводят в куриные эмбрионы или месячных цыплят. Положительным результатом считается гибель зародышей и заболевание цыплят.
Вакцинация
Вакцинацию от псевдочумы необходимо проводить в следующих случаях:
Существует два вида вакцины от болезни Ньюкасла:
Метод введения вакцины выбирается исходя из количества птицы и её предназначения:
В качестве иммунизации используют определённые штаммы вируса в зависимости от вида подворья и возраста птенцов:
Карантин и профилактика
Так как болезнь Ньюкасла очень быстро распространяется и характеризуется высоким падежом, а эффективного лечения всё ещё не существует, то большое внимание уделяют мерам профилактики. К ним относятся:
При подозрении на заражение срочно проводят мероприятия на выделение вируса. Если они дают положительный результат, то на предприятии устанавливается карантин. Он включает следующие процедуры:
Снимается карантин только после осуществления всех санитарно-гигиенических мероприятий и устранения заболевания. Обычно продолжительность карантина составляет 1–2 месяца.
Опасна ли болезнь для человека?
Псевдочума не представляет смертельной опасности для человека, но заразиться он может. В зоне риска находятся люди, работающие на птицефабриках и находящиеся в непосредственном контакте с больными птицами.
В организм человека возбудитель проникает через дыхательные пути или глаза при отсутствии должной гигиены рук. Первые симптомы проявляются спустя 3–7 дней после инфицирования:
Людям для того, чтобы обезопасить себя от заражения, нужно придерживаться несложных рекомендаций:
Болезнь Ньюкасла у птиц отличается характерными симптомами и отсутствием эффективного лечения. Это очень заразное и смертельно опасное заболевание. Поэтому необходимо вовремя провести диагностику и выделить вирус, чтобы не допустить вспышки инфекции и её распространения за пределы очага.
Болезнь Ньюкасла
Продолжая тему болезней домашней птицы, нельзя не уделить внимание нескольким опасным инфекционным заболеваниям, которые часто встречаются при занятии приусадебным птицеводством. Одно из них – болезнь Ньюкасла.
Известна она и под другими названиями: псевдочума птицы или азиатская чума. Впервые её обнаружили и идентифицировали как отдельную болезнь в 1926 году, на острове Ява, что и послужило появлению названия «азиатская чума». Затем случай заболевания птицы был зафиксирован возле города Ньюкасл в 1927 году – так инфекция получила своё второе название. С тех пор болезнь распространилась почти повсеместно.
Болеть могут все представители отряда куриных, как дикие, так и домашние: куры, индейки, перепела, цесарки, фазаны, куропатки, глухари, тетерева и другие пернатые. Заболевание вызывает вирус, который легко передаётся от одной особи к другой через продукты жизнедеятельности или при непосредственном контакте.
Наиболее вероятные источники распространения инфекции – это больная или заражённая птица, трупы пораженной болезнью и погибшей в результате этого птицы, тушки и боенские отходы инфицированных особей, их яйца, перья, помёт. В окружающей среде, при обычных условиях, вирус очень устойчив: в обсеменнённых кормах он может сохраняться до полутора месяцев; в воде – около трёх месяцев. В сухой пыли и на поверхности вентиляционных каналов птицеводческих помещений вирус остаётся жизнеспособным около 157 суток, в помёте и других выделениях больного поголовья – до 120 дней. Замораживание консервирует его надолго: в замороженном мясе, в яичном меланже вирус сохраняет свою патогенность несколько лет.
Перечисленные свойства вируса делают возможными источниками заражения данным возбудителем инфицированные помещения, выгульные площадки, клетки, тару для яиц, инвентарь, предметы ухода, кормушки и поилки с находящимся в них содержимым, спецодежду обслуживающего персонала, продукцию птицеводства, полученную от заражённого поголовья и многие другие предметы, которые были в контакте с больной птицей.
Кипячение убивает возбудителя мгновенно. 2% раствор едкого натра или хлорной извести – за три часа. Дезинфицировать воздух можно при температуре +18. 20°С аэрозолью формалина в дозе 35 мл на 1 кубометр объема помещения.
После заражения здоровой птицы одним из перечисленных способов первые симптомы могут проявиться через 4 – 12 суток. Птица становится вялой, теряет аппетит и активность. Дыхание её в этот период становится затруднённым, появляются хрипы, кашель, чихание. Потом из ноздрей, клюва, глаз начинает выделяться слизь. Изменяется голос, появляются каркающие звуки. Появляется понос с зеленоватым оттенком кала и примесями крови. Клюв из-за наполненности носовых ходов слизью часто остаётся открытым.
По мере развития болезни гребень и серёжки приобретают синюшный цвет, походка становится шаткой, иногда проявляются параличи и парезы конечностей и шеи. (Паралич – это полная неспособность опорно-двигательной системы к выполнению движений, а парез – это только существенное уменьшение силы мышц и ограничение количества выполняемых произвольных движений.) Первоначальное угнетение постепенно прогрессирует и переходит в сонливость, которая позже сменяется коматозным состоянием или полным параличем. Смертность составляет от 10% до 100% и зависит от формы течения заболевания.
Болезнь может протекать в нескольких формах. При молниеносном течении перечисленные клинические признаки не успевают проявиться, и заражённая птица гибнет внезапно за несколько часов. В этом случае смертность самая высокая: от 90 до 100%. При остром течении птица болеет несколько дней, при этом температура её тела повышается до +44°С, и наблюдаются все или часть перечисленных симптомов. Смертность заболевшего поголовья также очень высокая и часто достигает 85%.
При подострой форме Ньюкаслской болезни наблюдаются только судороги, поражение слизистой оболочки глаз, дыхательной и пищеварительной систем, а парезы и параличи менее выражены. Гибнет около 65 – 75% заболевшего поголовья. При хроническом течении симптомы выражены намного слабее, поражения конъюнктивы, органов дыхания и пищеварения почти не отмечается, но проявляются судороги и парезы, во многих случаях происходит запрокидывание головы, перекручивание шеи, хромота, отвисание крыльев, опущение головы. Гибнет около 35 – 40% больного поголовья.
Наиболее лёгкая – атипичная форма течения болезни. При ней все симптомы выражены очень слабо, часто хозяева или обслуживающий персонал их могут даже не заметить или не идентифицировать как признаки болезни. В этом случае гибнет около 10 – 25% заражённой птицы.
Для постановки точного диагноза зачастую не обойтись без лабораторного исследования. Из-за различных форм своего протекания и множества симптомов, болезнь Ньюкасла по некоторым признакам может быть похожа на птичий грипп, инфекционный энцефаломиелит, респираторный микоплазмоз, инфекционный бронхит, ларинго-трахеит, гиповитаминозы В, Е, D, бурсальную болезнь, кокцидиоз, колибактериоз, пастереллёз и некоторые другие заболевания.
Как видим, болезнь Ньюкасла – очень серьёзная и опасная для птицеводческих хозяйств. А особенно опасна она тем, что имеет высокую смертность, и при этом не разработаны эффективные способы её лечения. Поэтому меры профилактики приобретают особую важность. Наиболее действенным профилактическим мероприятием является вакцинация всего поголовья в неблагополучных по этому заболеванию регионах, а также вакцинация родительского стада в любых регионах.
Для искусственной иммунизации птицы чаще всего применяются вакцины «Ла-Сотта», «Полимун НХ Клон 124», «Бор-74» и другие. Перед вакцинацией птицу выдерживают без поения 3 – 4 часа, а после вакцинации воду можно давать не ранее чем через 1,5 часа. Прививать можно выпаиванием, закапывая раствор вакцины в ноздрю (0,1 мл или 2 капли на голову) или аэрозольно. Способ проведения иммунизации и сроки дальнейшей ревакцинации зависят от выбранной конкретной вакцины.
После закапывания (интраназальное введение) и выпаивания иммунитет наступает через 8 – 10 суток, а после аэрозольной вакцинации через 7 – 8 суток. В благополучных хозяйствах прививать можно всю птицу одновременно, начиная с 15-дневного возраста. В неблагополучных хозяйствах и при возникновении необходимости прививать следует с пятидневного возраста, а некоторыми вакцинами можно вакцинировать и с суточного возраста. Иногда у некоторых особей через 3 – 7 суток после вакцинации может снизиться яйценоскость, появиться понос, слабость, парезы и расстройства координации движений. В большинстве случаев эти симптомы проходят сами собой, но таких особей лучше выбраковать.
По ветеринарным правилам, в хозяйстве при обнаружении заболевания прекращается любое перемещение птицы, птицеферма изолируется, и в радиусе 5 км накладывается карантин с обязательной вакцинацией всей птицы на этой территории. Всю больную и подозрительную птицу забивают бескровным способом и утилизируют.
Клинически здоровое поголовье забивают на мясо или вакцинируют и забивают после достижения им убойной кондиции. Карантин снимают через месяц после последнего случая заболевания или убоя всего поголовья. Подстилку, остаток корма из кормушек, насесты сжигают. Помещения дезинфицируют аэрозолью формалина и 3% раствором формалина с едким натром, после чего их выдерживают без птицы 2 месяца.
Для человека болезнь Ньюкасла не опасна в силу видовых особенностей. Но при работе с больной птицей не следует игнорировать правила личной гигиены.
В следующей статье мы продолжим знакомиться с болезнями домашней птицы. А возникшие по теме статьи вопросы можно задать на нашем форуме.
