Как все закручено. 21 вариант того, как может выглядеть ваша ДНК
Мы привыкли представлять себе ДНК в виде двойной спирали — но это лишь одно из множества ее обличий. С тех пор, как Уотсон и Крик опубликовали свою модель, в клетках человека нашли тройную и четверную спираль ДНК, а еще кресты, шпильки и другие варианты переплетения — некоторые проще нарисовать, чем описать словами.
Набросать идей
Уотсон и Крик не были единственными, кто корпел над трехмерной моделью ДНК. Они даже не были первыми. На обрывках биохимических данных можно было построить самые разные молекулярные формы, и вариантов было множество.
Условия задачи у всех были одинаковы. На начало 1953 года уже было понятно, как устроен нуклеотид:
остаток фосфорной кислоты,
одно из азотистых оснований: аденин (А), гуанин (Г), тимин (Т) или цитозин (Ц).
Еще было известно, что азотистые основания разбросаны по цепи не случайно: в любой молекуле ДНК суммарное количество аденинов и гуанинов строго равнялось количеству тиминов и цитозинов. Кроме того, на всех рентгеновских снимках Розалинд Франклин и Рэймонда Гослинга, независимо от того, какой участок ДНК на них был запечатлен, сама нить имела одну и ту же толщину. Это означало, что форма остается неизменной при любой последовательности нуклеотидов.
Из этих вводных Лайнус Полинг и Роберт Кори собрали свою модель — тройную спираль, ощетинившуюся со всех сторон азотистыми основаниями (фосфату и сахару биохимики отвели роль внутреннего стержня). Эта конструкция выглядела неустойчивой: было непонятно, почему отрицательно заряженные фосфатные группы в центре спирали не отталкиваются друг от друга.
Структура ДНК по версии Полинга и Кори
Linus Pauling, Robert B. Corey / PNAS, 1953
Эту проблему решил Брюс Фрезер, вывернув конструкцию наизнанку: в его варианте три нити смотрели фосфатами наружу. Азотистые основания были обращены внутрь, однако Фрезер так и не смог объяснить, по какому принципу они соединены.
Модель Уотсона и Крика с закрученной вправо двойной спиралью оказалась самой устойчивой. Как и Фрезер, ученые расположили фосфаты снаружи, а азотистые основания — внутри. Был в этой модели и четкий принцип их противопоставления: А на одной цепи всегда соединялся с Т на другой, а Г — с Ц. Это объясняло, почему толщина конструкции стабильна — пары А-Т и Г-Ц примерно одинакового размера.
Карандашный набросок структуры ДНК, сделанный Фрэнсисом Криком
Wellcome Images / CC BY-SA 4.0
Потом были и другие попытки пересобрать ДНК в новую форму. Голландский биохимик Карст Хугстин, например, заметил, что можно соединить те же самые пары нуклеотидов другими гранями, — так спираль тоже оставалась стабильной, но получалась тоньше. Другие авторы изображали ДНК в виде спирали с чередующимися правым и левым поворотами, или даже в виде двух двойных спиралей, которые образуют единую четверку. И хотя существование Уотсон-Криковской двойной спирали с тех пор много раз подтвердилось, в XXI веке продолжают размышлять о том, какие формы принимает нить ДНК внутри клетки, где ее разглядеть намного сложнее, чем в пробирке. Правда, ни одна из альтернативных идей до сих пор не оказалась достаточно хороша, чтобы отказаться от классической правозакрученной двойной спирали.
Уотсон и Крик сделали нечто большее, чем просто разрешили споры о форме ДНК. Их модель сразу же объяснила, как эта форма работает: взаимно однозначное соответствие делает каждую нить шаблоном для другой. Имея только одну из цепей, по ней всегда можно восстановить вторую — на этот принцип опираются все современные модели передачи генетической информации.
Тем не менее, большинство «отвергнутых» идей в чем-то оказались верны. За почти 70 лет пристального разглядывания ДНК в ней удалось обнаружить практически все возможные виды соединения оснований, другие спирали и даже левый поворот.
Свернуть не туда
Уже сама по себе двойная спираль может быть устроена по-разному. Это заметила еще Розалинд Франклин, хотя и не предполагала, что перед ней спираль, да еще и двойная. В обычных условиях, напоминающих внутриклеточные, ДНК на снимках биолога имела «рыхлую» форму, которую Франклин назвала В-ДНК. Но если влажность в пробирке опускалась ниже 75 процентов, получалась А-ДНК, пошире и поплотнее.
А (слева) и В (справа) формы ДНК, какими их увидела Розалинд Франклин
Rosalind Franlkin, Raymond Gosling / Acta Crystallographica, 1953
Как выяснилось потом, А-ДНК действительно закручена туже: в ней на виток спирали уходит 10 нуклеотидов, а не 11, как в В-ДНК. И расположены они не перпендикулярно оси симметрии спирали, а под углом: если в В-ДНК нуклеотиды обычно изображают горизонтальными черточками, в А-ДНК их следовало бы рисовать косыми.
Уотсон и Крик выбрали В-ДНК в качестве основы для своей модели и не прогадали. Позже оказалось, что В-вариант действительно встречается в клетке гораздо чаще, и сейчас его считают основной формой существования ДНК, а все отклонения часто обозначают общим термином «не-В ДНК».
Более того, реальная двойная спираль почти никогда не соответствует своей идиллической модели. В живых системах В-ДНК, как правило, скручена чуть сильнее, чем предсказывали Уотсон и Крик, и среднее число нуклеотидов на виток спирали в ней — не 10 и не 11, а около 10,5. Кроме того, отдельные пары нуклеотидов постоянно отклоняются от положенной «горизонтали» (это называют «пропеллерным поворотом») поэтому спираль никогда не бывает абсолютно гладкой и ровной — то тут, то там по ее бокам торчат шероховатости: концы нуклеотидов под разными углами.
«Пропеллерный» поворот нуклеотидов в В-ДНК
James D. Watson et al. / Molecular Biology of the Gene, 2008
Позже оказалось, что витки спирали могут не только лежать туже или расслабленнее, но и вовсе закручиваться против часовой стрелки (например, влево закручена спираль башни «Эволюция» в Москва-сити, явно символизирующая нить ДНК). По странному стечению обстоятельств, именно такую ДНК увидели в 1979 году, когда появилась наконец возможность рассмотреть нуклеиновые кислоты с высоким разрешением. Это все еще была двойная спираль, но совсем другой формы: 12 нуклеотидов на виток, еще тоньше, чем В-ДНК и закрученная не вправо, а влево. Торчащие ее на поверхности фосфатные группы образовывали не плавную спираль, а зигзаг, поэтому новый вариант назвали Z-формой.
А-ДНК (слева), B-ДНК (по центру), Z-ДНК (справа)
Mauroesguerroto / wikimedia commons / CC BY-SA 4.0
Это, конечно, не означало, что Уотсон-Криковская модель неверна. Z-форму удалось получить при достаточно экзотических условиях — в растворе с высокой концентрацией солей. И в клетке она тоже получается из В-ДНК лишь при определенных обстоятельствах: например, когда «напряжение» на цепи слишком высоко и его необходимо сбросить. Напряжение появляется из-за чрезмерного скручивания: нити ДНК и так завернуты друг относительно друга, но образованная ими двойная спираль накручивается на какой-нибудь белок (например, гистон), возникает так называемая суперспирализация. Переход в Z-форму помогает сбросить напряжение и развернуть лишние витки — а это, в свою очередь, важно, чтобы с ДНК могли связываться новые белки, например, полимераза при транскрипции.
Поэтому ДНК часто принимает Z-форму при транскрипции генов. Более того, чем больше при этом Z-ДНК, тем активнее идет транскрипция. Гистоны с Z-ДНК связаться не могут, поэтому полимеразе никто не мешает заниматься своим делом. И этим, кстати говоря, активно пользуются опухолевые клетки, у которых левозакрученная спираль вовремя возникает перед нужными им генами.
Башня «Эволюция» (на переднем плане) имеет вид левозакрученной ДНК
Потом нашлись и другие формы двойной спирали. В зависимости от влажности, содержания солей и последовательности нуклеотидов в конкретном участке, ДНК может еще сильнее удлиняться (Е-ДНК) или сжиматься (C— и D-ДНК), включать в себя ионы металлов (М-ДНК) или вытягиваться так, что вместо азотистых оснований в центре спирали оказываются фосфатные группы (S-ДНК). А после того, как в список добавились другие типы внутриклеточной ДНК, вроде ядерной N-ДНК и рекомбинантной R-ДНК (которые, впрочем, попали в этот список не из-за своей формы, а положения в клетке или происхождения), в английском алфавите для вариантов ДНК практически закончились буквы. Тому, кто решит открыть еще какую-нибудь неканоническую форму, придется выбирать из пяти свободных: F, Q, U, V, и Y.
Алфавитный перечень форм ДНК
Попасть в переплет
Помимо всевозможных форм двойной спирали и способов ее плетения, ДНК иногда распадается на отдельные нити, которые образуют в шпильки, кресты и другие двуцепочечные фигуры. Случается и так, что уже существующая двойная спираль обрастает новыми соседями.
В 1985 году выяснилось, что Полинг и Кори тридцать лет назад были правы: тройная спираль ДНК (H-ДНК) существует. Однако устроена она совсем не так, как они предполагали. В настоящей тройной спирали две цепи соединяются стандартным, Уотсон-Криковским способом, а третья примыкает к ним сбоку, ложась в большую бороздку между цепями. При этом азотистые основания третьей, дополнительной нити соединяются с основными парами не классическим способом, а как бы сбоку — теми самыми связями, которые предсказывал Карст Хугстин. Он тоже, в некотором роде, оказался прав.
Тройная спираль, как и многие альтернативные формы ДНК, тоже возникает в ответ на суперспирализацию цепи. Однако, в отличие от Z-формы, она не поддерживает транскрипцию, а наоборот, ей препятствует. РНК-полимераза, которая привычно расплетает две нити перед собой, не всегда справляется с тем, чтобы разделить триплекс. Поэтому если в гене или его регуляторных областях образуется тройная спираль, он работает хуже прочих.
Варианты образования тройной спирали. Уотсон-Криковские пары обозначены черным, добавочный третий нуклеотид выделен цветом
Yutaro Yamagata et al. / Chemistry Europe, 2015
Бывает и так, что соединяются не две и не три, а сразу четыре цепи ДНК. Чтобы это произошло, в одном месте должны встретиться четыре гуаниновых нуклеотида — и неважно, находятся они на двух цепях одной нити или на четырех разных нитях, не связанных друг с другом. Каждый гуанин образует неклассическую, хугстиновскую пару с двумя соседями, а все вместе они создают квадратную гуаниновую тетраду. Если рядом с ними находятся другие гуанины, способные создать квадрат, то из них складывается стэк — стопка, которая удерживает рядом четыре цепи ДНК.
Гуаниновая тетрада (сверху) и варианты расположения цепей в квадруплексе (снизу)
Jochen Spiegel et al. / Trends in Chemistry, 2020
Все 30 лет, что прошли с момента открытия квадруплексов, количество процессов, в которых они так или иначе замешаны, растет. Известно уже больше двух сотен белков, которые могут избирательно распознавать гуаниновые тетрады — вероятно, последние выполняют роль своего рода генетической разметки, очередного способа регулировать упаковку и транскрипцию генов. Например, они часто встречаются в промоторах (регуляторных участках, с которых начинается транскрипция) разных генов. Совсем недавно ученым даже удалось отличить разные типы рака груди через наборы квадруплексов — от них, в свою очередь, зависело, какие гены в опухолевых клетках были гиперактивны.
Чем дальше мы вглядываемся в молекулу ДНК, тем больше замечаем отклонений от давно привычной модели. Двойная спираль — не единственная и не окончательная структура ДНК, а лишь одна (пусть и самая частая) из поз, которую та принимает в непрерывном танце. Повинуясь велению нуклеотидной последовательности, нить ДНК сжимается и разжимается, изгибается, закручивается и принимает бесконечное число (прекрасных) форм. Ни одна из них — не окончательная: альтернативные структуры ДНК переходят друг в друга, конкурируют с В-формой и между собой, подчиняются сигналам клеточных белков и сами направляют их работу.
Найти и возглавить
Неканонические формы ДНК, при всем своем разнообразии, не возникают в случайных местах. Устойчивость им придает определенный набор нуклеотидов в их составе, поэтому и появляются они лишь в тех участках цепи, где для них есть «удобная» последовательность.
Так, например, в ДНК есть определенные участки, которые особенно охотно сворачиваются в зигзаг. Это места, где чередуются пары Г-Ц: после левого поворота в них каждый второй нуклеотид принимает «неправильную» форму, отсюда и ломаный профиль всей Z-формы. Это означает, что последовательности, склонные принимать Z-форму, можно найти прямо в тексте — если видите ГЦГЦГЦГЦГЦГЦ, то вряд ли прогадаете. Так в одной работе, например, насчитали 391 такой участок в человеческом геноме.
Места, в которых может образоваться тройная спираль, тоже можно узнать по характерной последовательности нуклеотидов. Третья цепь присоединяется либо по принципу комплементарности — то есть к паре Г-Ц добавляется еще один Г, образуя Г-Ц*Г — либо «к своему» — и получается Г*Г-Ц. Поэтому часто такая конструкция возникает в тех местах ДНК, где подряд идет несколько одинаковых (например, ГГГГГ) или химически близких (АГГААГ) нуклеотидов и где они образуют палиндромные (зеркальные) повторы.
Точно также по тексту ДНК можно предсказать и появление квадруплексов. По результатам только одного секвенирования (собственно, прямого перевода ДНК в буквы), в геноме человека их нашлось более 700 тысяч. Не все они, вероятно, встречаются in vivo — для этого соответствующем нитям ДНК нужно оказаться рядом в одной точке сложно устроенного клеточного ядра — однако это может означать, что четырехспиральным структурам отведена какая-то специфическая роль в жизни клетки.
Далеко не всегда образование альтернативных форм ДНК идет клетке на пользу: большинство из них куда менее прочны, чем обычная В-ДНК, и гораздо чаще рвутся. Поэтому последовательности, которые склонны образовывать не-В формы, становятся участками генетической нестабильности и повышенного мутагенеза. Одни исследователи видят в этом двигатель эволюции — если такие участки появляются в генах, связанных с развитием организма. Другие же винят альтернативные формы ДНК во всех видах болезней, связанных со случайными мутациями и перестановками в геноме — от опухолей до шизофрении и аутизма.
Получается, что ДНК содержит не только информацию о строении клеточных белков и РНК, но и о том, какие формы эта информация может принимать, помимо Уотсон-Криковского стандарта. А уже от этих форм, в свою очередь, зависит то, что с этой информацией произойдет: сможет ли клетка ее реализовать или ген, будет вечно молчать, а то и вовсе сломается, породив какие-то дополнительные мутации.
Вероятно, мы научимся однажды вмешиваться в этот процесс — можно было бы, например, построить цепь нуклеотидов, которая имитировала бы третью цепь в спирали и «подсунуть» ее в нужное время в нужном месте, чтобы заблокировать работу какого-нибудь нежелательного гена в клетке. Были даже более смелые предложения — использовать тройную спираль для прицельного редактирования генома: ввести в клетку нуклеотид, который сможет образовать с целевым участком ДНК тройную спираль и побудить систему репарации заменить этот участок на «здоровый» вариант с другой хромосомы.
А пока мы этому только учимся, остается признать структуру ДНК еще одним видом информации — помимо генетической (нуклеотидного «текста») и эпигенетической (доступности генов для считывания) — который несет в себе наш геном. И нам еще предстоит научиться с ним работать, влияя через форму на содержание, или наоборот.
Трехспиральная макромолекула ДНК, как символ триединства
Эти третьи нематериальные спирали представляют собой ребра кристаллических энергоинформационных решёток и являются основой для построения обычных материальных спиралей ДНК. Отметим, что такие спирали энергоинформационных решёток лежат в основе и объектов неживой природы. Например, в металлах и минералах они проявлены в виде атомных и молекулярных пространственных кристаллических решёток.
Принцип трёхспиральности ДНК
Жезл Кадуцей Меркурия
Жезл Кадуцей Меркурия (Гермеса Трисмегиста, наряду со Святой Троицей, является символом Триединства Мироздания, тройной спирали Космической ДНК и трёх главных энергетических каналов человека: Ида, Пингала и Сушумна. Именно активизация трёхспиральной ДНК откроет Человечеству путь к Совершенству
Поэтому этот жезл является также символом Мудрости, Целительства, Спасения, Обновления и Возрождения Жизни.
Тройная спираль Космической ДНК
Поскольку Солнечная система является многополярным образованием (в неё входят не только Солнце, Земля и Луна, но и другие планеты), то с учётом её дальнейшего эволюционного развития она вместе с системой Сириуса представляет собой Многоспиральную Космическую ДНК. Энергоинформационные спирали этой ДНК, по которым движутся планеты, активизируются в процессе эволюции Солнечной системы.
Отметим, что, кроме звёздной системы Сириуса, мы энергетически связаны и с другими своими звёздными двойниками. На один из таких двойников как раз и произойдёт Квантовый переход нашей Солнечной системы, на пороге которого мы находимся. Этот переход должен произойти до 2013 года.
Реалии ДНК-«аномалии»
Реалии ДНК-«аномалии»
Автор
Редактор
Статья на конкурс «био/мол/текст»: ДНК — двойная спираль? Не всегда. Отдельные островки наших молекул наследственности могут по ошибке принимать довольно экзотические формы. Например, сворачиваться в спирали из четырех полигуаниновых нитей — вопреки классическим принципам молекулярной биологии. Но действительно ли подобные аномалии возникают «по ошибке»? Или природа давно уже «оседлала» эту странность нуклеиновых кислот, поставив её себе на службу? Можно ли считать четверные G-спирали рабочими «деталями» сложнейшей машины геномной регуляции? И случайна ли их причастность к процессам старения и канцерогенеза?
Обратите внимание!
Эта работа заняла первое место в номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» конкурса «био/мол/текст»-2015.
Спонсором номинации «Лучшая статья о механизмах старения и долголетия» является фонд «Наука за продление жизни». Спонсором приза зрительских симпатий выступила фирма Helicon.
Спонсоры конкурса: Лаборатория биотехнологических исследований 3D Bioprinting Solutions и Студия научной графики, анимации и моделирования Visual Science.
В мистическом фильме Д. Аронофски «Фонтан» присутствует весьма интересный образ. Конкистадор, отправившийся по велению испанской королевы на поиски древа вечной жизни (далекими прототипами героев здесь, по-видимому, послужили первооткрыватель Флориды Понсе де Леон и король Испании Фердинанд), находит его в храме индейцев Майя в Южной Америке. Однако, вкусив млечного сока этого древа, герой понимает, что что-то пошло не так. Вместо того чтобы обрести бессмертие, он начинает прорастать цветущей травой и полностью становится субстратом для этой буйной, паразитической по сути, растительности. Иными словами, у человека и у природы могут быть разные, если можно так выразиться, представления о жизненной силе и долголетии. И, возможно, именно поэтому в поисках путей продления жизни, мы постоянно натыкаемся на опасность канцерогенеза. Будь это исследования в области стволовых клеток, попытки преодолеть так называемый предел Хейфлика с помощью фермента теломеразы либо иные способы борьбы с клеточным старением. Всякий раз геронтология и онкология идут «рука об руку», теснейшим образом переплетаясь. И одной из точек сопряжения этих двух областей можно считать удивительные структурные аномалии ДНК, носящие название G-квадруплексов.
ДНК не по канону
Мы привыкли думать о ДНК как о двойной спирали, в которой азотистые основания нуклеотидов на противоположных цепях однозначно соответствуют друг другу: аденин — тимину, гуанин — цитозину. Эта, безусловно, фундаментальная особенность нуклеиновых кислот лежит в основе механизмов наследственности. Именно благодаря ей становятся возможными удвоение и корректирование ДНК, а также реализация генетической информации в структуре РНК и белков.
Однако на деле наши молекулы наследственности оказываются куда гибче, подвижнее и причудливее, нежели это было некогда описано легендарными нобелевскими лауреатами Дж. Уотсоном и Ф. Криком. Например, подобно РНК, ДНК может формировать так называемые шпильки, которые на двойной спирали приобретают вид крестообразных структур (рис. 1). Эти «аномальные» образования принимают активное участие в регуляции работы с генетической информацией и задействованы как в копировании ДНК (репликации) [1], так и в переносе информации с ДНК на РНК (транскрипции) [2].
Рисунок 1. Формирование крестоообразных структур ДНК. Рисунок с сайта www.physoc.org.
Конечно, «крестами» и шпильками дело не ограничивается. К числу возможных конформаций ДНК относятся также тройные (рис. 2Б) и даже четверные спирали (рис. 2В), возникающие в результате неканонических связей между азотистыми основаниями [3]. В течение последнего десятилетия заметно возросло внимание к так называемым G-квадруплексам — структурам, представляющим собой спирали из четырех нитей ДНК или РНК, соединенных одними только гуанинами. Постепенно выясняется, что эти образования играют весьма важную роль в регуляции активности генов, в генетической изменчивости и в функционировании теломер [4].
Рисунок 2. Двойная (а), тройная (б) и четверная (в) спирали ДНК. Рисунок с сайта www.konan-fiber.jp.
Рисунок 3. «G-ДНК». а. Строение G-тетрады; М + — одновалентный катион. б. Формирование G-квадруплекса из 1) одной, 2) двух и 3) четырех нитей ДНК. Рисунок с сайта www.chem.cmu.edu.
Способность гуанина к самоассоциации была обнаружена еще в конце 19 века. И только в 1962 году удалось установить, что в растворах он образует агрегаты из четырех молекул (называемых G-квартетом, или G-тетрадой) [5]. Такие тетрады скрепляются между собой неканоническими (то есть, не предусмотренными в модели Уотсона — Крика) водородными связями, называемыми «хугстиновскими» — по фамилии их первооткрывателя [6]. При этом входящие в них гуанины располагаются в одной плоскости и нуждаются в стабилизации моновалентными катионами (например, K + или Na + ) (рис. 3а).
Содержащие гуанин нуклеиновые кислоты в растворе могут образовывать такие структуры из одной, двух или четырех различных нитей (рис. 3б). Однако стабильными они будут лишь в том случае, когда три и более G-тетрады сгруппируются в плотную «стопку», «подперев» друг друга межплоскостными стекинг-взаимодействиями и сформировав тем самым G-квадруплекс (G4-структуру). А для этого, в свою очередь, необходима «счастливая встреча» четырех полигуаниновых участков (GGGn), находящихся либо на одной, либо на разных молекулах ДНК или РНК [7].
Нанопроводники
Интересно, что полигуаниновые цепи ДНК в растворе образуют четырехспиральные жгуты, для которых, к слову, зафиксирована способность эффективно проводить ток. Это свойство создает перспективу их использования в качестве нанопроводников [8, 9].
Правда, на каждое правило есть свои исключения. Здесь можно привести в пример синдром ломкой X-хромосомы, возникающий вследствие экспансии многочисленных (более 200) повторов (CGG) в гене FMR1, необходимом для развития нервной системы. Матричная РНК такого мутантного гена способна формировать вполне стабильные четверные спирали даже из двухгуаниновых мотивов. То есть, в нашей «стопке» будет всего лишь две G-тетрады (рис. 4) [10].
«Значит, это кому-нибудь нужно?» © В. Маяковский
Рисунок 4. «Двуслойный» квадруплекс, формирующийся из четырех мотивов (GG) на РНК гена FMR1 при синдроме ломкой X-хромосомы. Рисунок с сайта www.computer.org.
Разумеется, то, что возможно в пробирке, далеко не всегда имеет место в живой клетке. Однако последние годы было убедительно показано, что G-квадруплексы действительно образуются in vivo в хромосомах живых организмов [11, 12]. И, кроме того, методами биоинформатики в геноме человека обнаружено порядка 376 тысяч районов, в которых потенциально могут возникать эти четырехспиральные образования. Интересно, что такие участки, как правило, находятся в составе регуляторных генетических элементов (промоторов, терминаторов, нетранслируемых последовательностей матричной РНК), теломер, рибосомных РНК и интронов, то есть последовательностей, не кодирующих структуру белка. Тогда как кодирующие фрагменты ДНК (экзоны) преимущественно «очищены» от подобных нуклеотидных мотивов [13, 14]. И неудивительно! Ведь, забегая вперед, нельзя не отметить, что такие гуаниновые «узелки» способны становиться очагами генетической нестабильности, провоцируя появление серьезных мутаций. Поэтому направленность естественного отбора в данном случае вполне понятна.
Однако почему-то всё тот же естественный отбор способствовал заметному скоплению потенциальных G4-структур в области генных промоторов, то есть, участков ДНК, определяющих производительность данного гена и позволяющих её регулировать [13]. Причем особенно ярко это выражено в группе онкогенов, повышенная активность которых необходима для возникновения и развития раковых опухолей. Тогда как, к примеру, встречаемость вероятных G-квадруплексов в промоторах генов — супрессоров раковых опухолей (призванных подавлять канцерогенез) значительно ниже, чем в среднем по геному [15, 16]. Более того, последовательности многих промоторов и интронов, особо обогащенных потенциальными G4-структурами, достаточно консервативны, то есть несут общие черты у целого ряда эукариотических организмов [17, 18].
Картину дополняет то обстоятельство, что живые системы не пожалели времени и сил на выработку специальных белков, способных связываться с G-квадруплексами, либо формируя и стабилизируя их, либо «разворачивая», «расплетая» или просто разрезая [19]. Бесполезным или «не существующим» в клетке структурам (каковыми их вплоть до недавнего времени считали многие исследователи) эволюция столько внимания не уделяет. Как отметил более 30 лет назад нобелевский лауреат Аарон Клуг: «Если G-квадруплексы так легко формируются in vitro, природа, должно быть, нашла путь применения их in vivo» [4]. С каждым годом мы получаем всё больше подтверждений этому прозорливому высказыванию.
Из двойной спирали — в четверную
Чтобы сформировать в ДНК такую крупную структуру, как G-квадруплекс, необходимо предварительно подвергнуть плавлению (разъединить) соответствующий участок классической двойной спирали. Длина таких участков может составлять несколько десятков нуклеотидов. К примеру, общая формула для поиска потенциальных G4-структур в геноме, использованная в работах исследователей из Кэмбриджского университета, выглядела как (G3+N1—7G3+N1—7G3+N1—7G3) — то есть, предполагала длину квадруплекса от 15 до 33 пар оснований [13] (хотя это далеко не единственный вариант [14]). Теоретически G-квадруплексы могут возникнуть практически в любом месте генома— при условии образования достаточно длинного однонитевого ДНК-фрагмента [16]. Другое дело, что по показателям стабильности они будут существенно проигрывать.
Наиболее благоприятные условия для высвобождения протяженных кусочков одноцепочечной ДНК создаются, прежде всего, во время репликации. И действительно: количество G4-структур в клетке заметно (приблизительно в пять раз) возрастает именно при удвоении хромосом [20]. В идеале, по завершении копирования наследственного материала все гуаниновые «узелки» (и старые, и новые) должны удаляться, поскольку в это время клетка буквально «причесывает» свою ДНК. Однако, как показывает практика, часть G-квадруплексов остается и присутствует в геноме на протяжении всего клеточного цикла [11, 12, 20]. Более того, по-видимому, сам процесс репликации нуждается в наличии G4-структур. В частности, они входят в состав ориджинов (геномных районов, с которых начинается репликация) позвоночных животных и, по одной из версий, определяют направление движения ДНК-полимеразы — «копировальной машины» ДНК [21, 22].
Образованию четверных гуаниновых спиралей могут способствовать не только репликация, но и транскрипция (считывание гена), а также репарация (починка) хромосом [23]. Кроме того, в ядре возможно спонтанное плавление двойной спирали ДНК, возникающее в результате тех или иных молекулярных эффектов [24, 25]. В конце концов, появление G4-структур может быть обусловлено целенаправленным воздействием на ДНК специальных белков — шаперонов, призванных формировать квадруплексы там, где это положено [19].
Куда легче дело обстоит с РНК, однонитевыми по своей природе молекулами. Исключительная гибкость и отсутствие «обременения» в виде второй комплементарной цепочки позволяет им свободно принимать самые разнообразные конформации. И не случайно потенциальные G4-спирали нашлись в нетранслируемых (то есть, входящих в состав матричной РНК, но структуру белка не кодирующих) областях более чем 3000 человеческих генов [26, 27]. Кроме того, в последние годы перспективным представляется исследование гибридных квадруплексов, состоящих из ДНК и РНК. Интересно, что для их формирования достаточно не четырех, а всего лишь двух полигуаниновых участков на ДНК (два других автоматически будут присутствовать на считываемой с гена РНК) [28].
На самом краю хромосомы
А теперь — всё внимание таким удивительным ядерным структурам, как теломеры [29]! Располагаясь на концах линейных хромосом ядерных организмов, они призваны защищать генетический материал от разрушения. Структуры всех эукариотических теломер удивительно консервативны: они представляют собой цепочку из многократно повторяющихся нуклеотидных мотивов. В человеческом геноме это мотив (TTAGGG) (обратим внимание читателя на тройной гуанин), воспроизведенный 1000–2000 раз [30]! Не правда ли, идеальная среда для возникновения многочисленных G-квадруплексов? Но и это еще не всё: на конце теломер человека и других теплокровных животных располагается довольно протяженный, 30–300 нуклеотидов, участок однонитевой ДНК со свободным 3’-концом [31]. Состоит он из всё тех же повторов (ТТАGGG). И уж здесь-то образованию гуаниновых узелков ничто не мешает.
Теломерные последовательности, будучи извлеченными из ядра или синтезированными, действительно массово формируют G-квадруплексы [4]. Однако доказательство их наличия в клетке требует куда более тонких подходов. С помощью меченых антител, специфически связывающихся с G4-структурами, было показано, что последние действительно образуются на концах хромосом (правда, не всех). По крайней мере, около 20% всех сигналов были зафиксированы именно там [20]. Возникают ли обнаруженные квадруплексы собственно в теломерах либо в близлежащих областях хромосом, по этим данным сказать трудно, поскольку разрешение метода сильно ограничено. Однако нам достоверно известно, что многие теломерные белки действительно взаимодействуют с G4-структурами (либо формируя их, либо разрушая), и это один из главных аргументов в пользу их полноценного участия в жизни теломер [19]. А уж о том, что эта «жизнь» чрезвычайно важна для нас в контексте вопроса о здоровье и долголетии, говорить не приходится.
Судя по всему, G-квадруплексы задействованы в формировании защитного колпачка, или кэпа, на конце теломеры. В клетках человека такое «кэпирование» осуществляется шелтерином — комплексом из шести белков. Он предохраняет линейную хромосому от излишнего внимания клеточных «контролёров», считающих, что конец цепочки ДНК — это повреждение, требующее соответствующих методов «лечения». А в области теломер такое «лечение» оборачивается катастрофическими последствиями: «сшивкой» разных хромосом и, в итоге, гибелью клетки либо запуском канцерогенеза [32].
С G4-структурами взаимодействуют такие шелтериновые белки, как TRF2 и POT1. При этом TRF2 связывает и стабилизирует квадруплексы на однонитевом 3’-фрагменте, тогда как POT1 обусловливает распад гуаниновых четверных спиралей [19]. Иными словами, квадруплексы при образовании «кэпа» нужны, но дозированно.
Предполагаются самые разнообразные варианты участия G4 ДНК в «кэпировании» хромосом [33]. G-квадруплекс может быть необходим для образования специфической теломерной структуры, именуемой T-петлей (теломерной петлей) (рис. 5, 6а). Он возникает либо при простом запетливании однонитевого 3’-фрагмента (рис. 6б), либо при его внедрении в двойную спираль теломерной ДНК (рис. 6в) [34]. Таким образом осуществляется маскировка свободного 3’-конца (в общем случае распознаваемого клеткой как сигнал тревоги) [33].
Рисунок 5. Т-петля на конце теломеры под электронным микроскопом. Фото с сайта web.pdx.edu.
Рисунок 6. Различные виды Т-петель. а. T-петля без квадруплекса; б. T-петля с квадруплексом, замыкающим однонитевой 3’-фрагмент теломеры на себя; в. T-петля, образующая квадруплекс при внедрении однонитевого 3’-конца в двойную спираль теломерной ДНК. Рисунок с сайта pubs.rsc.org.
Помимо этого, обсуждаются альтернативные T-петле способы «кэпирования» хромосом. По одной из версий, одноцепочечная 3’-ДНК формирует плотный ряд G-квадруплексов, стабилизирующих однонитевой фрагмент и предохраняющих его от деградации особо ретивыми клеточными белками (рис. 7) [35]. Вероятно, подобный способ защиты теломеры используется в тех случаях, когда полноценного шелтерина на конце хромосомы не образуется [36].
Рисунок 7. Защита теломеры с помощью серии G-квадруплексов, образующихся на однонитевом 3’-конце. Рисунок из [4].
Не исключено, что в клетках человека в той или иной мере реализуются оба способа «обороны» теломеры с участием G4-образований. Иное дело, что такая «оборона» может оборачиваться для нас рядом неприятных моментов.
Точка обратного отсчета
Согласно наиболее популярной точке зрения, именно в теломерах спрятан ключ (по крайней мере, один из главных таких ключей) к пониманию процесса старения и ограниченной продолжительности нашей жизни. Линейные хромосомы, в отличие от циклических, коими могут похвастаться большинство доядерных организмов, как правило, не способны удваиваться вечно. Каждый цикл репликации, в силу особенностей организации этого ферментативного механизма, приводит к укорочению одной из дочерних нитей ДНК на 50–100 нуклеотидов. В итоге, после 50–60 раундов копирования наследственного материала потери в длине теломеры становятся неприемлемыми, поэтому клетка запускает процесс своего старения (сенесценции) либо гибнет [30, 37]. Правда, всем известные стволовые клетки являются ярким исключением из этого общего правила [38, 39]. (А еще — клетки растений, меняющие длину теломер в зависимости от времени года [40].)
Исследуя механизмы старения человека, невозможно обойти вниманием такое наследственное заболевание как синдром Вернера. Проявляется оно в ускоренном старении организма и сопровождается всеми сопутствующими эффектами: снижением иммунитета, повышением риска раковых заболеваний, многочисленными физиологическими нарушениями, характерными для людей преклонного возраста. Причиной этого синдрома оказалось нарушение структуры белка — геликазы WRN, основной функцией которого является расплетание теломерных квадруплексов. В результате во время репликации синтез дочерней цепи ДНК тормозится и обрывается в месте образования G4-структуры. Это приводит к галопирующему укорочению теломер и, соответственно, раннему запуску клеточного старения [41]. Аналогичного эффекта в культурах клеток можно добиться искусственным путем, повышая стойкость квадруплексов за счет их связывания со специальными химическими веществами [42].
Можно спорить по поводу применимости модели наследственного заболевания в деле расшифровки механизмов нормального, не патологичного старения. Однако совершенно не исключено, что не расплетенные вовремя теломерные квадруплексы задействованы и в этом случае. Вспомним, к примеру, как долгое время считалось, что синдром прогерии Хатчинсона-Гилфорда, связанный с преждевременным старением у детей, не имеет отношения к старению как таковому. В дальнейшем же было показано, что вызывающий эту болезнь прогерин образуется и в коже обычных пожилых людей [43].
Помимо этого, не секрет, что одной из вероятных причин старения является накопление в геноме повреждений, вызванных окислением свободными радикалами [44]. Причем существенная часть из них концентрируется именно на теломерах [45]. Возможных объяснений такому предпочтительному поражению кончиков хромосом довольно много. По-видимому, в этом виновны и сниженная (силами шелтериновых белков) активность ферментов «ремонта» ДНК, и особенности нуклеотидной последовательности теломерной ДНК. И здесь опять имеет смысл вспомнить про наши G-квадруплексы! Ведь они, помимо всего прочего, оказываются особенно чувствительными к окислительным повреждениям [46].
Смертельно опасная «вечная» жизнь
Говоря о теломерных G4-структурах, нельзя обойти вниманием тот интригующий факт, что, располагаясь на концах 3’-выступа, они блокируют работу теломеразы. А ведь это тот самый широко популяризованный фермент, на который возлагалось столько надежд, и за изучение которого в 2009 году была вручена Нобелевская премия по физиологии и медицине! Теломераза наращивает 3’-концы теломер и таким образом нивелирует их естественное укорочение. Иными словами — продлевает активную жизнь хромосомам и, соответственно, клетке [29]. Однако G-квадруплексы не просто мешают теломеразе делать свое дело — помимо этого, они, располагаясь в области промотора гена TERT, подавляют ее синтез в клетке [47]. И, конечно, этот эффект можно было бы счесть за негативный, если бы не один весьма печальный факт. Дело в том, что избыточная активность теломеразы создает весьма благоприятную среду для перерождения нормальных клеток в раковые. От работы этого фермента сильно зависят порядка 90% всех злокачественных опухолей, ведь он позволяет перерожденным клеткам делиться бесконечно долго [47].
Блокирование работы теломеразы составляет одну из функций гена BRCA1. BRCA1 — широко известный супрессор раковых опухолей, то есть ген — «борец» с канцерогенезом. Он является важным компонентом системы исправления ошибок в ДНК и контролирует активность целого ряда генов, в том числе задействованных в образовании опухолей [48]. Поэтому мутации в BRCA1 зачастую приводят к развитию рака груди и яичников [49], а в России они — в «лидерах» генетических причин возникновения онкозаболеваний [50]. Интересно, что подавление теломеразы этим (весьма немаловажным, как мы убедились) белком осуществляется не только за счет регуляции активности кодирующего её гена TERT [51], но и за счет прямого вмешательства в её работу на теломерах. В частности, предполагают, что BRCA1 связывается с теломерными квадруплексами и стабилизирует их, в результате чего наш «фермент молодости» остаётся не у дел [19].
Как было отмечено выше, TERT — отнюдь не единственный регулируемый G-квадруплексами ген, благоприятствующий развитию злокачественных опухолей [15]. Помимо него в этом ряду фигурируют c-MYC, c-KIT, BLC2, VEGF, HIF-1a и целый ряд других известных онкогенов [52]. Разумеется, такая закономерность не могла не привлечь внимания ученых, занятых поиском средств против рака. Сегодня существует целый ряд работ, посвященных влиянию тех или иных квадруплекс-связывающих веществ на рост и развитие раковых клеток. И, по результатам этих исследований, искусственное укрепление G-квадруплексов представляется чрезвычайно перспективным путем лечения онкологических заболеваний [47, 52].
По лезвию бритвы
Как гласит известная легенда, Будда Шакьямуни обрел просветление, услышав фразу учителя музыки, адресованную его ученику: «Если ты ослабишь струну, музыка не зазвучит, а если ты перетянешь её, она порвется». И этот принцип в полной мере относится ко множеству, если не ко всем биологическим процессам.
Те же самые G4-структуры, которые столь перспективны в рамках лечения раковых опухолей, могут сами по себе становиться провокаторами канцерогенных заболеваний. Вспомним вышеупомянутый синдром преждевременного старения Вернера. Возникает он на фоне недееспособности геликазы WRN, в норме «развязывающей» гуаниновые «узелки» на теломерах. В наших клетках существует целый спектр таких белков, призванных тем или иным способом удалять G-квадруплексы, дабы освободить дорогу ферментам репликации. Если же этого не происходит, то копирование ДНК стопорится в месте образования G4-структуры. В результате запускается целый ряд процессов, приводящих к разрывам ДНК, хромосомным перестройкам и мутациям наследственного материала [36, 41].
Так, например, при повреждении гена специализированной на G-квадруплексах геликазы BLM возникает синдром Блума. Проявляется он в низкорослости и ранней предрасположенности к целому ряду онкозаболеваний. Нарушение функции геликазы FANJ приводит к развитию анемии Фалькони, сопровождающейся повышенной хрупкостью хромосом и склонностью к лейкозам. Аналогичным образом мутации в гене геликазы RETL1 увеличивают чувствительность организма к некоторым видам рака. Этот список можно было бы продолжить целым рядом наследственных заболеваний, провоцирующих канцерогенез. И все они связаны с генетической и теломерной нестабильностью, вызванной «стойкими» ДНК- и РНК-квадруплексами [41].
Иными словами, чтобы «музыка», исполняемая оркестром генных и теломерных G-квадруплексов, звучала, необходима тонкая настройка их жесткости. По-видимому, мы имеем дело с чрезвычайно широкой и сложной сетью структурных ДНК-аномалий. Возникающих как спонтанно, так и при помощи специальных белков. Чувствительных как к молекулярному окружению, так и к физико-химическим условиям среды. Способных как предотвращать раковые заболевания, так и провоцировать их. Принимающих участие как в защите теломер, так и в процессах клеточного старения.
