микобактерии туберкулеза можно выявить при микроскопии окрашенного препарата по тест
Лабораторные методы исследования при туберкулезе
Мокроту лучше собирать утром. Предварительно больной должен прополоскать рот, чтобы в мокроте было меньше слюны. При малом количестве мокроты ее собирают в течение суток.
При отсутствии мокроты следует вызвать ее появление раздражающими ингаляциями аэрозоля гипертонического раствора поваренной соли с содой.
Исследуют также промывные воды бронхов, получаемые после введения через трахею 10—12 мл теплого изотонического раствора хлорида натрия.
Исследование мокроты начинают с ее осмотра. У больных туберкулезом легких в мокроте могут быть прожилки или сгустки крови, кусочки обызвествленных камней бронхов — бронхолитов.
При микроскопическом исследовании окрашенных мазков мокроты у больных с деструкцией легочной ткани выявляются эластические волокна. Иногда встречаются так называемые коралловые волокна, которые образуются в результате отложения на эластических волокнах жирных кислот, а также покрытые известью эластические волокна и аморфные известковые частицы.
Для выявления в мокроте МБТ ее исследуют неоднократно, направляя в лабораторию утреннюю порцию не менее 3 дней подряд. В ряде случаев МБТ могут быть обнаружены в мокроте и при отсутствии рентгенологических изменений в легких (в этом случае нельзя исключить и язвенный туберкулез бронха). Проводить исследование мокроты необходимо до начала противотуберкулезной химиотерапии.
Выявление МБТ в патологическом материале осуществляется бактериоскопическим, бактериологическим (культуральным) и биологическим методами.
Кроме мокроты, объектами исследования для обнаружения МБТ могут быть также моча, кал, спинномозговая жидкость, экссудат из полостей, биоптаты различных тканей.
Основным методом выявления МБТ является бактериоскопический. Во многих развивающихся странах он широко применяется не только для диагностики, но и для выявления больных туберкулезом при массовых обследованиях населения.
При прямой бактериоскопии препарат окрашивают по методу Циля — Нильсена: вначале карболовым раствором фуксина, а затем после обесцвечивания 5 % раствором серной кислоты или 3 % раствором солянокислого спирта, докрашивают 0,25 % раствором метиленового синего. Окрашенные препараты микроскопируют в иммерсионной системе. МБТ окрашиваются в красный, а окружающий фон и некислотоустойчивые микроорганизмы — в синий цвет.
Информативность бактериоскопического метода выявления МБТ увеличивается на 14—30 % при применении люминесцентной микроскопии. Для окраски препарата используют флюорохромы — органические красители, флюоресцирующие при освещении ультрафиолетовыми, фиолетовыми или синими лучами. Такими красителями являются аурамин, родамин С. Препарат исследуют с помощью люминесцентного микроскопа. МБТ светятся золотисто-желтым цветом на темном фоне.
Для обнаружения бактериоскопическим методом МБТ в препарате необходимо, чтобы в 1 мл мокроты содержалось не менее 100 000 микробных тел. При меньшем числе микобактерий исследование может дать ложноотрицательный результат.
Для увеличения количества МБТ в единице исследуемого объема мокроты используют методы флотации и седиментации, особенно при отрицательных результатах прямой бактериоскопии.
Наибольшее распространение получил метод флотации, основанный на том, что после встряхивания водной суспензии с углеводородом МБТ всплывают вместе с образующейся пеной на поверхность. В качестве углеводорода используют бензин, бензол, ксилол. Образующееся на поверхности сливкообразное (флотационное) кольцо из частиц углеводорода с микобактериями служит материалом для приготовления препаратов. При использовании метода флотации число положительных результатов бактериоскопии увеличивается на 10 %.
Бактериологический (культуральный) метод выявления МБТ заключается в посеве мокроты на питательные среды. Перед посевом мокроту обрабатывают с целью подавления роста неспецифической микрофлоры. Стандартной питательной средой для выращивания МБТ служит твердая яичная среда Левенштейна — Йенсена. Существуют также полужидкие и жидкие питательные среды. Рост культуры МБТ происходит за 14—90 дней.
Для выделения культуры МБТ достаточно 20—100 микробных клеток в 1 мл мокроты. Получение чистой культуры микобактерий позволяет определить их жизнеспособность, вирулентность, а также чувствительность к лекарственным препаратам.
Нередко определяемые при бактериоскопии микобактерии не растут на питательных средах вследствие утраты способности к размножению под влиянием химиопрепаратов. По данным бактериологического исследования проводится количественная оценка бактериовыделения: скудное — до 50 колоний на среде и обильное — более 50 колоний.
Биологический метод заключается в заражении инфицированной мокротой животных (морских свинок), обладающих высокой чувствительностью к МБТ.
Перед заражением животных мокроту обрабатывают серной кислотой с целью уничтожения неспецифической микрофлоры и центрифугируют. Осадок (в изотоническом растворе хлорида натрия) вводят свинке подкожно в паховую область, внутрибрюшинно или в яичко. С целью снижения резистентности морской свинки к МБТ ей ежедневно вводят большие дозы кортизона. Примерно через месяц после заражения у свинки увеличиваются лимфатические узлы и развивается генерализованный туберкулез.
Среди методов выявления МБТ и диагностики туберкулеза биологический метод до последнего времени считался наиболее чувствительным, так как туберкулез у морских свинок может быть вызван при введении мокроты, содержащей менее 5 микробных тел в 1 мл.
В настоящее время доказана возможность потери вирулентности микобактериями туберкулеза. Такие микобактерии жизнеспособны, могут расти на питательных средах, но не вызывают заболевания экспериментальных животных. Поэтому для выявления в патологическом материале МБТ необходимо применять различные методы микробиологического исследования.
Изменение числа лейкоцитов и лейкоцитарной формулы крови происходит главным образом при острых процессах и распаде легочной ткани. Могут наблюдаться лейкоцитоз, увеличение числа палочкоядерных нейтрофилов, лимфопения, моноцитоз, эозинопения.
Для оценки состояния больного, его неспецифической и специфической реактивности, а также для определения активности туберкулезного процесса и выбора оптимальной лечебной тактики существенное значение имеет определение некоторых биохимических и иммунологических показателей.
У больных туберкулезом, выделяющих большое количество мокроты, с обильным гнойным плевральным экссудатом, амилоидозом почек может иметь место гипопротеинемия в отличие от больных с другими формами туберкулеза.
При остром туберкулезном воспалении уменьшается альбумин-глобулиновый коэффициент, увеличивается содержание в плазме фибриногена и сиаловых кислот, появляется С-реактивный белок.
Для контроля функционального состояния печени и почек в крови определяют содержание аланиновой и аспарагиновой аминотрансфераз, щелочной фосфатазы, билирубина, уровень остаточного азота, мочевины, креатинина, с сывороткой крови ставят коагуляционные пробы — тимоловую, сулемовую. С целью исключения часто сочетающегося с туберкулезом сахарного диабета в крови определяют содержание глюкозы.
Для подтверждения туберкулезной этиологии заболевания используют иммуноферментный метод, основанный на реакции антиген — антитело. При подозрении на иммунодефицит в сыворотке крови определяют содержание иммуноглобулинов. Для диагностики иммунодефицита и контроля за его течением определяют количество В- и Т-лимфоцитов.
При активном туберкулезе все иммунологические реакции положительны, причем их выраженность зависит от фазы туберкулезного процесса. У больных с благоприятным течением туберкулеза наиболее выражена реакция бласттрансформации лимфоцитов, а с прогрессирующим — реакция торможения миграции лейкоцитов в присутствии туберкулина ППД.
При вспышке процесса снижается число Т-розеткообразующих лимфоцитов и повышается число В-розеткообразующих лимфоцитов, одновременно уменьшается содержание G- и А-иммуноглобулинов.
Иммунологические тесты используются для дифференциальной диагностики туберкулеза. Например, при раке и саркоидозе в отличие от туберкулеза отмечается подавление активности Т-лимфоцитов в реакции бласттрансформации с фитогемагглютинином (ФГА), у большинства больных отмечаются отрицательные реакции бласттрансформации лимфоцитов и миграции лейкоцитов с ППД.
не дает существенной диагностической информации, но иногда выявляются серьезные осложнения основного заболевания. При туберкулезе почек в моче обнаруживают белок, лейкоциты, нередко эритроциты, а также МБТ. При осложнении легочного туберкулеза амилоидозом наблюдаются стойкая протеинурия, микрогематурия.
По выделению с суточной мочой 17-кетостероидов и 17-оксикортикостероидов судят о функциональном состоянии коры надпочечников.
Микроскопическое исследование на микобактерию туберкулеза окрашенного мазка мокроты
Методы лабораторной диагностики туберкулеза весьма разнообразны как по характеру производимых исследований, так и по тому патологическому материалу, который подвергается исследованию. Кроме общепринятых исследований, используемых в практике при различных заболеваниях, в клинике туберкулеза применяются специальные лабораторные методы, связанные со спецификой этого заболевания. Получаемые результаты помогают клиницистам в дифференциальной диагностике процессов различной локализации, способствуют раннему выя влению туберкулеза, учитываются при выборе тех или иных методов лечения и определения его эффективности.
Несмотря на указанные недостатки, микроскопия остается одним из основных методов микробиологических исследований. Ее преимущество заключается в быстроте получения результата и относительной простоте исследования. Метод позволяет в короткие сроки обнаружить наиболее эпидемически опасных больных туберкулезом и микобактериозами, выделяющих большие количества микобактерий, и остается актуальным методом при выявлении больных туберкулезом и микобактериозами на первичных этапах обследования больных, а также при динамическом наблюдении за состоянием микобактериальной популяции в процессе лечения. Кроме того, микроскопическое подтверждение тинкториальных свойств культуры остается обязательным исследованием при ее диагностике. Человеческий туберкулез вызывают определенные бактерии, относящиеся к микобактериям. Но очень редко заболевание, схожее с туберкулезом, могут вызвать другие виды микобактерий, а также в мазке могут присутствовать неопасные микобактерии. Для более точного исследования используется бактериологический метод посева.
При подозрении на туберкулез всегда исследуется мокрота, так как легкие поражаются этим заболеванием наиболее часто. При ее отсутствии на исследование направляют промывные воды бронхов. Иногда для уточнения поражения туберкулезом других органов на исследование направляется моча, кал, отделяемое из ран и гнойников.
Микроскопия является предварительным методом исследования с целью выявления наиболее опасных форм туберкулеза («открытых»), при которых больной человек выделяет возбудителя заболевания в окружающую среду. При подозрении на туберкулез органов дыхания необходимо исследовать не менее трёх проб мокроты – это связано с особенностями выделения микобактерий из легких, а также чувствительностью методов исследования. Сбор мокроты осуществляют в течение 3-х дней подряд. Одновременно часть мокроты (или других жидкостей) направляется в бактериологическую лабораторию на посев.
Метод окраски по Ziehl-Neelsen (Цилю-Нильсену) является наиболее распространенным методом для выявления кислотоустойчивых микобактерий. Он основан на использовании нескольких специальных методических приемов:
Показания к назначению:
Пресс-центр
Вопрос-ответ: лабораторная диагностика туберкулеза
В Чувашской Республике проходит акция «Белая ромашка», посвященная Всемирному дню борьбы с туберкулезом, которая продлится до 20 апреля. О существовании этого недуга люди знали с древнейших времен. И в настоящее время туберкулез продолжает оставаться ведущей инфекционной болезнью, уносящей жизни людей во всем мире. Для
В распознавании и дифференциальной диагностике туберкулеза, а также в эффективности проводимого лечения очень важную роль играют лабораторные методы исследования. На наиболее распространенные вопросы о лабораторной диагностике туберкулеза отвечает заведующий бактериологической лабораторией Ольга Стебловская.
— Ольга Евгеньевна, расскажите, что такое МБТ?
— Где же находят эти туберкулёзные палочки?
Второе место по эффективности выделения МБТ у больных, не выделяющих мокроту, занимаю т исследования промывных вод бронхов.
— Как обнаруживают туберкулёзные палочки в лаборатории?
Частота обнаруж ения МБТ зависит от способа исследования биоматериала :
При бактериологическом способе исследования удается не только выявить туберкулезные палочки, но и подсчитать их количество, а также изучить лекарственную чувствительность к противотуберкулезным препаратам и составить схему лечения боль ного.
Бактериологический метод ( посев материала на специальные среды) обнаружения МБТ очень высокоточный, но имеет существенный недостаток: для получения культуры требуется 4-12 недель.
Применение жидких питательных сред и специального оборудования (бактериологических анализаторов) позволяет определить рост МБТ уже через 5дней.
В бактериологической лаборатории Республиканского противотуберкулезного диспансера представлен полный спектр методов для диагностики туберкулеза:
— бактериоскопические методы; кл ассический посев и определение л екарственной чувствительности МБТ на плотных средах;
— ускоренная методика на жидких средах с применением бактериологического анализатора BACTEC MGIT 960 ;
Лабораторные методы выявления микобактерий туберкулеза Методы обследования на МБТ
Бактериологическая диагностика включает обработку клинического материала, микроскопическое исследование, выделение микроорганизма с применением культуральных методов, идентификацию микобактерий с использованием бактериологических и биохимических гестов, а также определение лекарственной чувствительности микобактерий.
Существует несколько групп методов, используемых для выявления МБТ в различном диагностическом материале: рутинные (микроскопия, культуральное исследование), биологические (биопроба, определение вирулентности штаммов МБТ). автоматические системы (MGIT, ВАСТЕС, МВ/ВасТ, ESP Culture System и др.), молекулярной генетические методики (PCR. I.CR, NASBA, Q-Bela и др.). Каждый из этих методов обладает определенной чувствительностью и специфичностью, что необходимо учитывать при клинической интерпретации полученных результатов.
Бактериоскопическое исследование мокроты с окраской мазка по Цилю-Нильсену для выявления кислотоустойчивых микобактерий (КУБ) является наиболее быстрым, доступным и экономически эффективным из существующих методов выявления больных туберкулезом. Оно может быть осуществлено в любой клинико- диагностической лаборатории (КДЛ) лечебно-профилактических учреждений всех уровней и ведомств. Бактериоскопия мокроты представляется чрезвычайно информативной для выяснения эпидемиологической опасности пациента для окружающих, которая коррелирует с числом микобактерий в образце. Бактериоскопическое исследование, проведенное должным образом, имеет положительную прогностическую ценность для легочного туберкулеза, более 90%. Разрешающая способность данного метода составляет 50-100 тыс. микобактерий в 1 миллилитре мокроты и существенно зависит от ряда факторов: правильности сбора мокроты, подготовленности лабораторного персонала и разрешающей способности используемых микроскопов. При микроскопии мазков, приготовленных из проб, взятых в течение трех последовательных дней, результативность метода повышается на 20-30%. Однако нет необходимости использовать более 4-5 проб мокроты.
Метод окраски по Цилю-Нильсену наиболее часто используется при бакгериоскопичсском выявлении микобактерий. Он заключается в следующем: мазки мокроты окрашивают фуксином при нагревании, затем обесцвечивают солянокислым спиртом и докрашивают метиленовым синим. В результате микобактерий окрашиваются в малиновый цвет, а фон — в синий. Это специфическое окрашивание обусловлено способностью микобактерий удерживать краситель при обработке кислотой или спиртом.
Диагностика туберкулеза. Микробиологические исследования.
Консультант по гематологии,
цитохимии и микробиологии
Важное место в общем комплексе клинико-лабораторных исследований, применяемых для профилактики, диагностики и лечения гнойно-воспалительных заболеваний и осложнений у больных в лечебно-профилактических учреждениях занимают микробиологические исследования. Современная клиническая медицина предъявляет к микробиологическим (бактериологическим) исследованиям возрастающие требования по увеличению объема, повышению качества исследований, разработке и внедрению новых более совершенных методов. Это связано как с новыми научными достижениями в области эпидемиологии и бактериологии, так и с увеличением гнойно-воспалительных заболеваний, ростом госпитальных инфекций.
Чтобы диагностировать туберкулез, необходимо сделать все возможное для выявления возбудителя заболевания. Микробиологически диагноз может быть подтвержден на основе результатов культурального исследования на комплекс M. tuberculosis (или, при возможности, путем идентификации специфических последовательностей нуклеиновых кислот) в пробах, взятых в месте локализации патологического процесса. Однако на практике в настоящее время многие лаборатории не располагают материально-технической базой для проведения культуральных исследований. К счастью, микроскопия окрашенных препаратов мокроты доступна практически везде, поэтому диагностика туберкулеза может проводиться на основе выявления кислотоустойчивых микобактерий. На территориях с высокой распространенностью туберкулеза выявление кислотоустойчивых микобактерий в окрашенных препаратах мокроты демонстрирует высокую специфичность, поэтому положительный результат микроскопии мокроты можно рассматривать как подтверждение диагноза. Кроме высокой специфичности к комплексу M. tuberculosis, выявление кислотоустойчивых микобактерий при микроскопии играет важную роль по трем причинам: это – наиболее быстрый метод диагностики туберкулеза; позволяет выявить больных с тяжелым развитием патологии, чреватым высоким риском летального исхода; дает возможность выявить больных, являющихся распространителями инфекции.
Оценка качества работы лабораторий микроскопии должна проводиться соответствующим государственными органом (как правило, представителями национальной программы борьбы с туберкулезом).
Неправильный диагноз, поставленный перед началом лечения, приводит к риску ненужного, неправильного или неудачного лечения. Более того, подобный подход чреват несвоевременной постановкой правильного диагноза и назначением соответствующего лечения. При надлежащем подходе и контроле в большинстве случаев у детей в возрасте пяти лет и старше могут быть получены образцы мокроты. У подростков (хотя они часто относятся к детской возрастной группе, по крайней мере, до 15 лет) получить пробы мокроты не составляет большого труда. Поэтому фактор возраста не может рассматриваться как препятствие для сбора проб мокроты у детей и подростков.
Исходя из имеющихся данных, можно прийти к заключению, что для диагностики туберкулеза необходимо взять не менее двух проб мокроты. В случаях, когда имеются соответствующие возможности, можно направлять для лабораторного исследования еще и третью пробу, но исследование более трех проб мокроты вряд ли целесообразно, поскольку не может в значительной мере повысить эффективность диагностики. Кроме того, исследование третьей пробы может оказаться полезным только для подтверждения диагноза, если одна или две предыдущие пробы дали положительный результат. Крайне желательно, чтобы результаты микроскопии мокроты направлялись лечащему врачу в течение одного рабочего дня с момента отправки проб. Не меньшее значение имеет также и время сбора проб. Результаты исследований показывают, что эффективность лабораторных анализов максимальна, если пробы мокроты получены утром, после пробуждения от ночного сна. Возможно, совершенно необязательно собирать только утренние пробы, но, про крайней мере, одна из них должна быть получена утром.
Как правило, внелегочные очаги туберкулезного процесса содержат гораздо меньшее количество M. tuberculosis, поэтому микроскопическое выявление кислотоустойчивых микобактерий в пробах из внелегочных очагов весьма затруднено, и в таких случаях результаты культуральных исследований приобретают большое значение. Учитывая низкую результативность микроскопии, при внелегочном туберкулезе культуральные и морфологические исследования приобретают особое значение, например, в диагностическом исследовании проб ткани лимфатических узлов, полученных при помощи игловой биопсии.
Лечение пациентов, у которых наблюдаются тяжелое или быстро развивающееся заболевания, ассоциированные с туберкулезом, необходимо начинать немедленно, даже до лабораторного подтверждения диагноза. Лечение следует начинать до получения результатов лабораторного исследования и лишь позднее внести необходимые поправки и изменения в схему лечения с учетом результатов микроскопии.
Хотя микроскопия мокроты является наиболее доступным бактериологическим тестом, там, где ресурсы позволяют и имеются условия для качественной лабораторной диагностики, в диагностический алгоритм необходимо включать культуральные исследования мокроты, в случаях отрицательных результатов микроскопии. Правильное проведение культуральных исследований связано с определенными трудностями и дополнительными затратами, но этот метод отличается более высокой чувствительностью и повышает вероятность раннего выявления больных туберкулезом.
Микроскопия мазков мокроты по Циль-Нильсену позволяет быстро получить результаты, выявить основные источники инфекции, является менее дорогостоящей, чем посев мокроты и широко доступна для применения. Но она должна быть надежной и хорошо контролироваться. Вероятность обнаружения МБТ при бактериоскопии мазков мокроты прямо пропорциональна концентрации возбудителя в исследуемом материале. Например, когда в 1 мл мокроты содержится от 1000 до 10000 МБТ, то вероятность получения положительного результата составляет около 40-50%. При концентрации МБТ менее 1000 в 1 мл мокроты вероятность их обнаружения резко снижается – отрицательные результаты получаются примерно в 96% случаев.
Основным и наиболее часто изучаемым биоматериалом в пульмонологической практике является мокрота. Требования к забору и качеству мокроты следующие:
1) первую пробу мокроты желательно получить до начала курса антибиотикотерапии;
2) мокроту оптимально собирать утром, до приема пищи, после тщательного туалета полости рта (полоскание кипяченой водой);
3) больным нужно доступно объяснить, что требуется получить именно содержимое нижних отделов дыхательных путей, а не ротоглотки, и, по возможности, проконтролировать их действия;
4) забор материала проводить в стерильные интактные контейнеры;
5) продолжительность хранения мокроты в контейнерах не должна превышать 2 ч (в летнее время желательно не более 1 ч);
6) в условиях лаборатории качество мокроты оценивается после окрашивания мазка по Граму (при наличии в мазке менее 25 лейкоцитов и более 10 эпителиальных клеток, при просмотре не менее 8-10 полей зрения при малом увеличении, мокрота признается некачественной, дальнейшее ее исследование нецелесообразно, так как, скорее всего, материал получен из ротовой полости);
7) высокая диагностическая ценность исследования признается при выделении возбудителя в концентрации і106 КОЕ/мл.
Вообще, в диагностике заболеваний туберкулезом можно выделить несколько этапов:
· Преаналитический этап (предварительный диагноз, выбор материала и метода исследования, забор биомтериала и его транспортировка)
· Аналитический этап (непосредственно проведение анализа)
· Постаналитический этап (оценка результатов)
Часть этих этапов проводится вне лаборатории, поэтому очень важна согласованная и качественная работа всех специалистов, привлеченных в этот процесс. Важен правильный выбор исследуемого материала. Важным этапом диагностики являются процедуры взятия и доставки материала в лабораторию.При взятии всех видов исследуемого материала следует ориентироваться на стандартные системы для этой цели: тампоны, цитощетки, тубсеры, контейнеры и т.п. Эффективность аналитического этапа во многом определяется уровнем технического оснащения лабораторий. Постаналитический этап исследования включает две составляющие: проверку достоверности полученного результата и оценку этиологической значимости выделенных штаммов. В лаборатории должен осуществляться строгий внутренний контроль качества исследований, важной составляющей которого является проверка полученных результатов на достоверность. Оценка этиологической значимости выделенных микроорганизмов принципиальна для выбора адекватной терапии. Процедура приготовления мазков начинается с подготовки предметных стекол. Необходимо использовать только новые, отмытые и обезжиренные в спирте или смеси для обезжиривания предметных стекол (производство АБРИС+) стекла без царапин и сколов. При повторном использовании стекла могут быть недостаточно хорошо отмыты от предыдущего материала, что может привести к получению ложноположительных результатов. Не рекомендуется использовать саморезанные стекла, которые приводят к значительным аберрациям исследуемого изображения. Стекла должны соответствовать ГОСТу. Стекла, на которых при микроскопическом исследовании были обнаружены кислотоустойчивые микобактерии, сохраняются в лаборатории в течение 1 года, а затем подлежат обязательному уничтожению и не должны использоваться повторно. Новые предметные стекла кипятят 15 минут в 1% растворе питьевой соды (10 г двууглекислого натрия на 1 л воды), промывают в 1% растворе соляной кислоты (к 1 л воды добавляют 10 мл концентрированной соляной кислоты), а затем промывают в проточной воде и протирают насухо.